ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒） (以下简称ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA(酶联免疫吸附试验）法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

目前常用的ELISA方法有直接法、间接法、双抗夹心法和竞争法。

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双抗夹心ELISA实验原理

双抗体（原）夹心法，通常是结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

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双抗夹心ELISA样本制备

血清—操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

血浆—EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

细胞上清液—1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

组织匀浆—将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

保存—如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

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双抗夹心ELISA操作步骤

ELISA实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）。试剂或样品稀释时，确保混匀，同时尽量避免起泡。

1.包被抗体：用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS）根据实验需要，将包被抗体稀释到一定的稀释度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃过夜。

2.洗板：弃孔内液体，甩干，10mM PBST(10mM PBS + 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。

3.封闭：含1% BSA或者5%脱脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS + 0.05% Tween-20)做封闭液，350-400μl/孔，37℃、2h。

4.洗板：同步骤2。（备注：商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤，使用前请注意核实）。

5.加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。（注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 min内上完样品。）酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60-120min。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

6.洗板：弃孔内液体，甩干，10mM PBST（10mM PBS + 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）

7.加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用PBST稀释到一定的稀释度，100μl/孔，37℃、1h。

8.洗板：同步骤6。

9.加二抗：根据实验需要，将二抗用10mM PBST稀释到一定的稀释度，100μl/孔，37℃、1h。

10.洗板：同步骤6。

11.酶标仪读值：以630nm为校正波长，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5min内进行读数。

12.结果判断：a.每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；b.以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。

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ELISA实验疑难解析

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